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生物咖啡茶

本帖最后由 汇研生物 于 2019-7-29 13:49 编辑

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引言
    做大肠杆菌发酵也会遇到各种各样的问题,最防不胜防的是被噬菌体浸染,做大肠杆菌发酵的同学多多少少都遇到过被噬菌体浸染的时候,一旦被噬菌体浸染,真是劳身伤神,不但浪费发酵原料,耽误正常实验及工作,噬菌体浸染就是发酵人的噩梦!

大肠杆菌噬菌体
1.毒性噬菌体
指在宿主菌体内复制增殖,产生许多子代噬菌体,并最终裂解细菌。毒性噬菌体的增殖方式是复制,其增殖过程经历吸附穿入、生物合成和成熟释放3个阶段。

进入菌细胞内的噬菌体核酸首先经早期转录产生早期蛋白质,并复制子代核酸,再进行晚期转录产生噬菌体的结构蛋白。子代噬菌体达到一定数量时,由于噬菌体合成酶类的溶解,菌细胞突然裂解,释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌。

2.温和噬菌体
感染宿主菌后并不增殖。其基因整合于细菌染色体上,即前噬菌体,随细菌染色体的复制而复制,并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中。温和噬菌体有溶原性周期和溶茵性周期,可偶尔自发地或在某些理化或生物因素地影响下整合的前噬菌体脱离宿主菌染色体,进入溶菌性周期导致细菌裂解,并产生新的成熟噬菌体。

大肠杆菌浸染噬菌体的状态
大肠杆菌浸染毒性噬菌时,噬菌体的蛋白质和细菌表面的膜相互接触形成一定的孔道,把核酸也就是DNA或RNA注入进去,随着菌体的增长繁殖,噬菌体在菌体内产生子代噬菌体,子代噬菌体达到一定量后,菌体裂解,释放噬菌体感染更多的菌体,直至菌体全部被裂解,菌体浊液变澄清(刚开始裂解会释放菌体内的核酸使浊液变成粘稠的鼻涕状)。
大肠感觉浸染温和噬菌体后,噬菌体的的基因整合到菌体的染色体上,其基因随着菌体染色体的复制而复制,在一些条件刺激下,如诱导剂,温度变化等,整合在菌体染色体上的噬菌体基因脱落菌体,进入溶菌性周期。
大肠杆菌浸染噬菌体的鉴定
浸染毒性噬菌体检测方法:
双层琼脂平板法测定噬菌体操作(最常用方法)
器材以及药品: 
1.器材:试管及试管塞(已灭菌)、移液枪(200ul以及5ml)以及相应的无菌枪头、 90mm平板( 已灭菌)、250ml三角瓶、酒精灯、琼脂粉、分离提纯的噬菌体液以及敏感菌(已经活化好的)。
方法及步骤: 
1.配制培养基:LB液体培养基(1000ml水:10g蛋白胨:5g酵母粉:5g氯化钠)、1.5%的固体培养基、0.7%的半固体培养基; 
2.倒平板:将1.5%的固体培养基熔化,每个平板倒10-15ml的1.5%固体培养基,然后静置至平板上没有水珠为好,平板数根据实际需要而定; 
3.分装0.7%的半固体培养基:将0.7%的半固体培养基加热熔化,然后用5ml的移液枪向每个试管(已灭菌)加入5ml的半固体培养基;试管的数量和上一步平板数是相同的。如果试管很多,防止培养基凝固,可将已分装好的试管放入水浴温度为55℃左右的水浴锅中保温;
4.等到试管中培养基温度降至45 ℃-50 ℃之间(不烫手)时,迅速向试管中加入100ul敏感菌和100ul的噬菌体液(噬菌体浓度要适当,这样才能看到明显的噬菌斑),摇匀; 
5.将摇匀好的该培养基迅速倒入之前已倒有1.5%固体培养基平板中,晃动平板,使其铺满平板,静置; 
6.待所有平板倒好后(最好静置2h左右),将其放入30 ℃恒温箱中培养12h左右,即可观察有无噬菌斑。 
注:所有操作在酒精灯旁进行!

浸染温和噬菌体检测
浸染温和噬菌体后不像毒性噬菌体那样快速的使菌体裂解,和毒性噬菌体的检测方式有些差异,可以尝试用PCR的方式等去检测。
如何减少或避免噬菌体的浸染

大肠杆菌发酵时浸染噬菌体严重的影响工作的正常开展,在工作中更要严加防范。
建议防范措施:
1.从菌种克隆及保存开始,克隆菌种的感受态菌体及其它物料要保证纯净没有被污染,保存菌种的环境要洁净避免菌种保存过程中被污染(特别注意,发生异常的菌种要立马和其它菌种分开保存),且保存菌种的同时要保存质粒以备菌种异常时立马转化新菌种。
2.发酵时的培养基要保证没有被噬菌体浸染,特别是酵母浸膏可通过培养噬菌体的方式去检测其没有被浸染。
3.发酵场所要保持清洁,要定期进行消毒处理。
4.发酵系统中的空气系统要定期消毒并检查。
5.发酵种子制备的环境要保持洁净,并定期消毒。
6.发酵罐接种时要无菌操作,避免接种时污染。
7.发酵过程取样后的废液要进行收集灭菌处理。
8.发酵过程的尾气要处理后在排掉。
9.发酵液离心后的上清要进行灭菌处理,并和发酵空间隔开处理。
10.发酵系统中的补料设施要严格进行消毒处理。
11.定期检测发酵罐,避免消毒死角的存在。
12.发酵场所洒落的培养基等要及时清洗干净。
13.发酵场所的地沟,污水池等也要保持清洁,并定期消毒。
14.加强管理,规范操作,避免一切隐患和风险。
大肠杆菌发酵浸染噬菌体处理措施
大肠杆菌发酵过程中染噬菌体就像火山爆发,爆发后处理起来非常麻烦,而且在短时间很难处理干净,工程大肠杆菌发酵浸染噬菌体还是以规避为主,爆发后可通过以下措施进行处理:
首先要通过双层平板去检测是否是浸染了噬菌体,毒性噬菌体好检测,若是温和噬菌体难以发现,会让发酵过程间断性的发生异常,此时可通过PCR等方法检测是否浸染了温和噬菌体。
确定浸染噬菌体后,就要从菌种,培养基,环境,发酵系统管路,地沟,污水池,排风口等进行全面的消毒排查,物理消毒方式通常很难将噬菌体消除,通常需要物理和化学方式相结合处理噬菌体污染。

1)必要暂停发酵培养工作,对整个发酵环境,管路,器材进行消毒处理,可用紫外顶照射加甲醛熏蒸的方式对整个发酵场所进行消毒,在不影响生产的情况,可以停止发酵一个月的时间,让发酵环境的活大肠杆菌消除或减少到最低限度。
2)现有菌种做严格的噬菌体检测,一旦发现污染,马上和其它菌种隔离并进行灭菌处理。
3)用甲醛、臭氧或二氧化氯熏蒸环境(包括实验室、菌种室等位置);
4)用各类化学消毒剂(譬如75酒精、新洁尔灭、二氧化氯稀溶液等)清洁试验台、实验室墙面和设备等等固体表面;
5)有污染可能的液体,进行消毒后并处理在隔离发酵环境的其它场所,切勿将消毒的废液排到发酵环境的地沟及废水池中,容器用化学消毒剂清洗;
6)一旦爆发噬菌体污染,停止任何形式的活菌排放,也杜绝或尽量减少活菌开放性操作。

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发表于 2019-7-29 13:46:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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