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蛋白纯化手册已发布点击下面连接查看【经典版】最全蛋白纯化手册  

质粒DNA简介
质粒(plasmid)是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子,存在于细胞质中,具有自主复制能力,使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息,是闭合环状的双链DNA分子,分子大小1KB-200KB(1KB=650KD),是基因克隆常用的载体,随着基因治疗,细胞治疗及DNA疫苗的快速发展,快速高效的大规模工业化制备质粒DNA(pDNA)需求不断增加。

与蛋白质的情况一样,pDNA生产的工艺开发一般也从实验室规模开始,构建并筛选合适的表达载体和生产宿主,然后进行发酵条件的选择和优化(上游工艺),细胞生长,以及最后的分离和纯化步骤(下游工艺),工艺开发的每个阶段必需良好整合和衔接,而不是各自独立进行。

生物制品的下游工艺通常料液中杂质和污染物的影响,而后者又取决于上游处理和发酵条件。制定上游工艺和发酵阶段计划时的目的是设计、选择并优化合适的质粒载体,以实现稳定、超螺旋pDNA的大量生产。在这些阶段,必需考虑临床用载体的安全性和效力要求,以及pDNA大规模生产和纯化本身的要求。质粒载体和宿主菌株的“明智”选择,结合生长条件的优化(培养基和条件),可有效地提高质粒产量,降低细胞裂解时的RNA含量。
质粒DNA工业化开发工艺


粒DNA大规模纯化
质粒DNA纯化主要是去除核酸,内毒素及痕量的污染物,通常都是将重组质粒转化入大肠杆菌,大肠杆菌经过高密度发酵,然后固液分离,收集大肠杆菌,然后大肠杆菌经过碱裂解,裂解后在离心固液分离及微滤澄清,澄清后超滤浓缩,然后在层析纯化。


注意事项:
在凝胶过滤的时候选择4FF还是6FF填料,要看重组质粒的分子大小,小质粒选择6FF,大质粒选择4FF,那个效果好也可以通过平行实验对比分析。凝胶过滤主要去除RNA及部分内毒素,在高盐(2M硫酸铵的环境中RNA会被压缩,尺寸变小,所以凝胶过滤时缓冲液中可适量的添加一些盐)。

离子交换层析主要是去除痕量的杂质及内毒素,质粒尺寸比较大,建议使用大孔径的离心交换填料(DEAE/Q Focurose HPL),即可表面结合也可孔内结合,提高结合载量。

条条大路通罗马,到底怎么样的纯化工艺路线是最佳路线呢?没有捷径,这还需要根据质粒DNA的用途,特性进行实验验证,上面只是宏观的纯化思路,请您指正!
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发表于 2019-7-29 13:52:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

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