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辣根过氧化物酶简介
辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,简称HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶,早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶,以后又制备出结晶。通常试验中以辣根为原料,经过水的抽提,硫酸铵和丙酮分级分离,再经锌离子纯化,透析除盐,冰冻干燥,便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。


辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质,HRP广泛分布于植物界,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同功酶组成,Mr在40000左右,等电点7.2。溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕红色,透明。酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸铵溶液。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液,而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下,HRP几周内稳定,加热到63℃,在15min内稳定。 氧化还原电势很低,pH6.08时,E ' 0 =-0.2070V,pH为7.71时,E′0 =-0.2787V。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
辣根过氧化物酶特性挖掘
1.pI 7.2
2.有一定的耐热性:63℃,在15min内稳定
3.糖蛋白
4.溶于水,溶于58%以下浓度的硫酸氨
辣根过氧化物酶纯化策略
依据上面挖掘到的特性设计纯化工艺。

1.水提:辣根:0.85%氯化钠=1:5,匀浆,匀浆后离心收集上清;
2.分级盐析:先低浓度硫酸氨沉淀杂蛋白,然后在高浓度硫酸氨沉淀HRP;
3.热处理:60℃,水浴15min后离心收上清;
4.疏水层析:盐析的样品用20mM PB,pH6.0溶解到1.5M硫酸氨的电导率,过Phenyl Focurose 6FF层析;
5.亲和层析:热处理的上清液过ConA亲和层析;
6.置换缓冲液:疏水及亲和层析的洗脱峰可以用Focudex G-25脱盐柱进行缓冲液置换,使其适用于下一步纯化;
7.阳离子交换层析:CM Focurose 6FF层析,平衡液20mMPB pH 6.0,洗脱平衡液加氯化钠拉梯度洗脱;
8.复合型阳离子交换层析:CM洗脱峰稀释1倍后过MMCFocurose 6HF复合型阳离子,用改变pH的方式洗脱;
◆◆:工艺路线千万条,如何找到最佳工艺路线呢?做实验!!!
辣根过氧化物酶的应用
迄今为止ELISA中应用最为广泛的标记用酶。

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发表于 2019-7-29 14:00:30 | 显示全部楼层 |阅读模式

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