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生物咖啡茶

蛋白纯化手册已发布点击下面连接查看【经典版】最全蛋白纯化手册  
概论
制备出效价高,特异性强,稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础,抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败,不同的免疫学实验方法(如ELISA,IHC,IP,ICC,SDS-PAGE, WB等)对抗体的效价,浓度和纯度有不同的要求。我们知道,一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体,血清蛋白以及其他各种杂蛋白等,在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后,我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。下面就一一介绍常用抗体纯化方法及其相关原理。

沉淀法
硫酸铵/辛酸沉淀法是纯化抗体最传统的方法之一,被广泛用于血清和腹水抗体的浓缩和粗纯,此方法可大规模粗纯抗体,但纯化后纯度不高,还需配合其它方法继续纯化。
通常是将饱和硫酸加入血清或腹水中,将抗体沉淀下来,然后在溶解沉淀继续下一步的纯化。
辛酸沉淀抗体通常要先将腹水或血清的pH调至4.8,然后缓慢的滴加辛酸,是蛋白沉淀,抗体在上清中,上清继续下一步的纯化。
离子交换层析
离子交换层析也常用于抗体的纯化,通量大,工业上用离子交换层析成本低,主要用于除去非抗体蛋白,及用亲和层析纯化时混入的Protein A/G等亲和填料脱离的配基,内毒素的去除等。
离子交换纯化时,根据抗体的pI选择合适的离子交换类型,在pI未知时可以分别用阴阳离子交换填料去试验。
会用到的离子交换填料有:
DEAE/Q/CM/SP/MMA/MMC Focurose 6FF
MMA/MMC Focurose 6FF被广泛用于聚体和单体及内毒素的去除,MMA/MMC是复合型离子交换填料,层析过程洗脱时通常要用改变pH的方式洗脱。
Protein A/G亲和层析
Protein A/G亲和层析为从血清,腹水,细胞培养液中纯化单克隆抗体最快捷的方法,一步层析后纯度可以达到95%左右,不同来源不同亚型的抗体和Protein A/G的亲和力不同。protein A和proteiin G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和proteinG 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上,当抗血清从中流过时,特异性的IgG就与配基结合,其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同,我们需要具体情况具体对待,分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,猪的多克隆抗体用protein A纯化,而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。

Protein G与Protein A均可结合抗体的Fc段,不同的是,Protein G还能结合Fab段,且Protein G可以更广泛的结合更多类型的IgG分子,多克隆IgG分子,同时Protein G与血清蛋白结合水平低,产物纯度高,且配基脱落更低

Protein A和 Protein G与不同种属IgG的结合强度
种类
亚类
Protein A
Protein G
IgA
可变
-
IgD
-
-
IgE
-
-
IgG1
++++
++++
IgG2
++++
++++
IgG3
-
++++
IgG4
++++
++++
IgM
可变
-
豚鼠
IgG1
++++
++
IgG2
++++
++
仓鼠
/
+
++
小鼠
IgG1
+
++++
IgG2a
++++
++++
IgG2b
+++
+++
IgG3
++
+++
IgM
可变
-
大鼠
IgG1
-
+
IgG2a
-
++++
IgG2b
-
++
IgG3
+
++
/
++++
+++
禽蛋黄
IgY
-
-
/
++
+
/
+++
+++
/
++
++++
/
++
++++
绵羊
/
-/+
++
山羊
/
-
++
猴子
/
++++
++++
骆驼
/
-
+
/
-
+
“-”:不结合
“+”:弱结合
“++”:结合
“+++”:中等结合
“++++”:强结合

相关产品:Protein A/G Focurose 4FF
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发表于 2019-7-29 14:03:18 | 显示全部楼层 |阅读模式

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