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生物咖啡茶

本帖最后由 马尔文帕纳科 于 2019-12-24 11:28 编辑

蛋白质药物稳定性分析技术

作者:韩佩韦

     蛋白质药物稳定的高级结构对于蛋白质药物发挥功能至关重要,也决定了药物的有效性、生产可行性和安全性。稳定性较差的蛋白质高级结构不仅直接影响其药效,也增加了其形成蛋白质聚集体的可能性,从而导致不必要的免疫原性等药物安全问题。蛋白质药物的稳定性受多个方面影响,包括由其自身氨基酸序列组成、维系三维结构的非共价相互作用等因素影响的构象稳定性、蛋白质分子与其周围溶液环境中的其他蛋白质分子、溶剂分子、离子等的相互作用带来的胶体稳定性以及由于酶、化学降解造成的化学稳定性等多种因素影响。充分理解影响蛋白质稳定性的内在因素,如构象稳定性以及外在因素,如胶体稳定性和化学稳定性,对于指导蛋白质结构、优化工艺流程和配方成分有着很好的帮助。

       马尔文帕纳科公司是一家以粒度分析起家的企业,致力于为跨多个行业的企业用户提供从微米级别(激光粒度仪)至纳米级别(动态光散射,DLS)的粒度分布分析,同时也开发和收购了多种技术整合用于解决生物制药企业用户在研发和生产过程中遇到的问题。2014年,马尔文帕纳科公司收购了来自GE Life Sciences的MicroCal™品牌微量热分析平台,包括用于分析分子间相互作用的等温滴定量热仪(ITC)以及分析生物分子热稳定性的差式扫描量热仪(DSC),进一步丰富了其对于蛋白质药物稳定性分析的武器库。

       微量热差式扫描量热仪(DSC)以及动态光散射(DLS)被业内众多专家认为是蛋白质高级结构稳定性分析中非常有用的两大技术(Gabrielson and Weiss, J. Pharm. Sci. 104, 1240–1245 (2015))。在下面的热图中列出不同技术在蛋白质药物开发过程中的评价结果,颜色越浅的色块代表业内专家认为该技术在某阶段的实用性越好、而颜色越深的色块则代表业内专家认为该技术在某领域的实用性较低。可以看到,专家们认为,差式扫描量热仪(DSC)在蛋白候选物筛选、配方开发、生产一致性比较以及生物类似药相似性比较等领域实用性很高、而动态光散射(DLS)则在配方开发中更为实用。

图1.png

       差式扫描量热仪(DSC)是一种超灵敏的微量热仪,它通过在可控的升温速率下使蛋白质逐渐发生热变性,使蛋白质由其活性的天然结构去折叠成失活的变性结构-无规卷曲。在这个热变性的过程中,为了破坏维系蛋白质分子高级结构的非共价作用力,如氢键、范德华力、极性相互作用、离子键等,蛋白质需要吸收能量,从而使蛋白质逐渐从具有高级结构的构象转变为变性的无规卷曲。在这个平衡中,当有50%的蛋白质发生变性时,也就是【Native】=【Denatured】时,我们获得了一个特征的转变温度,Tm值(单位℃)。Tm值反映了蛋白质热变性的难易程度,Tm越高,一般说明蛋白质越稳定性;Tm越低,一般说明蛋白质越不稳定。DSC不仅能够获取整体蛋白质分子的Tm值,对于具有多个热稳定性不同结构域的蛋白质如单抗,DSC可以分辨出其不同结构域的Tm值,如C2H,Fab和C3H等。最新的MicroCal PEAQ-DSCAutomated(自动版)每天可以快速筛选多达50个样品,升温速度最高可达每小时240℃,而样品用量仅为325μl(浓度范围从0.01 mg/ml 至10 mg/ml),可筛选不同结构蛋白质的稳定性,多种组合的配方条件以及对生物类似药与原研药的相似度比较进行打分。详细的差式扫描量热仪(DSC)原理及最新的应用介绍大家可以访问并参考马尔文帕纳科网站:https://www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/microcal-range/microcal-dsc-range
图2.jpg

差示扫描微量热仪MicroCal DSC




        动态光散射(DLS)是一种分析胶体稳定性和粒径分析的重要工具。它通过对处于布朗运动状态中的纳米级胶体及聚体的散射光进行相关性(Correlation)分析,获取纳米级颗粒的粒径(nm),粒径分布(PDI)、Zeta电位(mV)以及颗粒绝对浓度(每毫升的颗粒数)信息,从而获取在不同环境条件下蛋白质的胶体稳定性。动态光散射(DLS)所采用的相关性算法最初源自军事应用中的雷达,也来自马尔文小镇附近。应用动态光散射技术,研究者可以获取蛋白质如抗体的粒径尺寸、粒径的分布以及微量聚体的检测用于样品纯度分析,同时,还可以获得随着温度和浓度的变化,蛋白质胶体聚集的形成趋势(Tagg)以及蛋白质与配方间的相互作用因子(Interaction Parameter KD,这里不是分子互作结合的亲和力)。动态光散射还被广泛的应用疫苗佐剂电位的测定和评估,用来评估疫苗稳定性。在最新的应用中,全新动态光散射仪Zetasizer UV结合使用多角度动态光(Multi-Angle DLS,MADLS)实现了对基因治疗领域中腺相关病毒(AAV)的定量分析。具体的DLS原理及最新应用介绍大家可以访问并参考:https://www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/zetasizer-range
图3.jpg
纳米粒度电位仪(Zetasizer Ultra&Pro)

       今后,我们希望利用这个平台,和大家分享一下马尔文帕纳科在蛋白质药物分析以及分子相互作用分析方面的技术和应用,并希望和大家进行交流,如有错误之处,敬请谅解并欢迎多提宝贵建议。

马尔文帕纳科中国
销售支持热线:+86400 630 6902

访问www.malvernpanalytical.com了解更多信息。







发表于 2019-12-24 11:22:37 | 显示全部楼层 |阅读模式

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